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        加強形態學檢查提高細菌鑒定的準確性

        檢驗醫學 2021-10-05 14:34:39

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        陳東科 ?衛生部北京醫院檢驗科

        孫長貴 ?解放軍第117醫院檢驗科


        細菌鑒定的原則之一就是用最少的試驗完成鑒定。細菌形態學檢查是最基本、簡單、快速的常規鑒定方法。細菌形態學包括細菌細胞形態學和細菌菌落形態學。細菌形態學正確描述依賴于方法、培養基、培養時間、染色試劑等,培養基和培養時間不同會影響細菌的形態。觀察細菌的典型形態,應該是將細菌接種在該細菌最適生長的培養基上、放入該細菌最適生長環境中(包括溫度和所需氣體條件)進行孵育,孵育時間應視細菌的生長速度而定,大部分常見的細菌以培養24h為宜,有些細菌需要更長時間的孵育才能顯現出典型的菌落特征。有時為了鑒別某一種或某一類細菌,需要觀察細菌在特殊的培養基(包括顯色培養基)上或在特定環境下(氣體、溫度和光線等)培養的形態特征[1,2,3]。

        1 菌落特征觀察


        細菌在固體培養基表面生長形成菌落。對菌落進行描述應包括菌落大?。ǚ执?、中、小,以1mm為界)、形狀、高度、邊緣、表面狀態、密度(透明度)、硬度(用接種環刮取菌落時的感覺)、菌落內部結構、顏色、光澤以及與培養基表面的黏附程度,還應包括菌落的溶血、氣味和色素產生情況等特性。觀察菌落特征的目的是為了對細菌進行初步鑒定。有些特征是某些細菌所特有的,具有屬或種的鑒別價值,如肺炎鏈球菌在綿羊血瓊脂平板上的臍窩狀菌落(如圖1所示)、伴放線凝集桿菌菌落特殊的內部結構(如圖2所示)、侵蝕艾肯菌的斗笠樣菌落、斯氏假單胞菌皺紋樣菌落、變形桿菌遷徙樣菌落、銅綠假單胞菌的水溶性色素、紫色色桿菌的脂溶性色素(如圖3所示)、粘質沙雷菌的紅色色素(如圖4所示)、產吲哚金黃桿菌產生的吲哚氣味、嗜血桿菌產生的鼠穴氣味、諾卡菌產生的腐土氣味、厭氧菌產生的腐氨氣味、熒光假單胞菌產生的黃色熒光素、某些厭氧菌可產生磚紅色熒光素等。有些細菌產生色素受到氣體的影響(粘質沙雷菌在厭氧環境下不產色),有些細菌產生色素受到光線的影響(某些快速生長分枝桿菌是光產色或暗產色)[4]。



        對細菌菌落特征的觀察和描述是細菌鑒定的第一步驟,其主要目的體現在以下幾方面。


        1.1 ?病原菌定量或半定量 在對標本進行定量或半定量接種后,通過菌落計數可獲得定量或半定量結果,細菌的定量在尿液分析和療效動態觀察中具有臨床意義,半定量適用于開放性標本的結果分析(確定優勢菌)。


        1.2 ?確定病原菌 開放性標本受炎癥組織周圍皮膚、黏膜的常居菌叢污染的可能性較大,觀察培養結果時應根據標本直接涂片鏡檢結果,結合菌落形態特征來確定病原菌。


        1.3 ?解釋血培養鏡檢結果 分析陽性血培養瓶的轉種結果時,應結合對陽性培養液直接涂片的鏡檢結果,如果涂片結果與培養結果不符,應考慮操作錯誤或是污染所致。


        1.4 ?確定鑒定方向 根據不同培養基上的菌落形態特征,結合革蘭染色鏡檢結果及快速輔助試驗(氧化酶、觸酶、凝固酶等)結果,可確定鑒定方向。

        2 ?菌體形態觀察


        革蘭染色細胞形態學是細菌分類學的基礎,臨床微生物學實驗室仍然使用細胞形態學的方法進行細菌鑒定,掌握細胞形態學的標準方法能夠為準確鑒定細菌提供可靠保證。對細菌菌體形態特征的觀察和描述是細菌鑒定的第二步驟,其主要目的體現在以下幾方面。


        2.1 ?解釋培養結果、確定鑒定方向 ?無論是液體培養(如血培養、標本直接增菌培養)或是固體培養(接種瓊脂平板),都應該將培養物進行涂片、染色鏡檢確定培養物的性質,即可快速報告,也是為下一步的鑒定指明方向。圖5所示為血培養陽性培養物涂片革蘭染色鏡檢結果。


        2.2 ?鑒別細菌的手段 ?細菌菌體形態結合菌落形態特征可對細菌進行鑒別。例如,在選擇性巧克力平板(加萬古霉素)上生長的草綠色溶血菌落,是乳桿菌還是腸球菌(VRE)只要涂片鏡檢就很容易區分;鮑曼不動桿與克雷白菌屬細菌的菌落形態相似,區別在于前者為革蘭陰性球桿菌(接近球菌),后者為革蘭陰性桿菌;丹毒絲菌在血平板上的菌落形態與草綠色鏈球菌很相像,但鏡下形態差別很大。圖6所示為紅斑丹毒絲菌的革蘭染色鏡下形態[4]。


        2.3 ?鑒定方向及試劑選擇的依據 葡萄球菌和鏈球菌、革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌的鑒定方向均不同,鑒定試劑選擇也不同。


        2.4 ?藥敏組合選擇的依據 CLSI文件規定,每一種細菌都有一定的抗菌藥物組合供選擇。要準確進行藥敏組合選擇,就必須有準確的細胞形態學結果作支持。




        3 ?菌體特殊結構的觀察[4]


        3.1 ?莢膜 ?莢膜是某些細菌在細胞壁外包裹的一層粘液性物質,不同的細菌其莢膜成分也有一定差異,一般由多糖、多肽或蛋白質組成。莢膜作為細菌的毒力因子有必要對其染色觀察,但莢膜染色對于臨床標本分離菌株的鑒定價值并不大。圖7所示為大腸埃希菌莢膜染色結果。


        3.2 ?鞭毛 觀察細菌鞭毛對于細菌鑒定具有重要的價值。依據鞭毛位置和數量,細菌分為單端極鞭毛菌、單端雙鞭毛菌、單端叢鞭毛菌、周鞭毛菌、側鞭毛菌。鞭毛是細菌的動力器官,大多數情況下可用動力試驗驗證細菌鞭毛的存在,但動力試驗無法代替鞭毛染色在細菌鑒定中的地位。圖8所示為霍亂弧菌鞭毛染色結果。


        3.3 ?芽胞 芽胞的形態包括芽胞形狀、芽胞位置和孢子囊膨大。芽胞形態分為圓柱形、橢圓形、球形,芽胞位置分為端生、近端生、中生或近中生。根據芽胞的形態學可以進行芽胞桿菌屬和梭菌屬的鑒定。芽胞染色并不優于革蘭染色,使用相差顯微鏡觀察芽胞優于芽胞染色和革蘭染色。圖9所示為艱難梭菌芽胞染色結果。


        3.4 ?異染顆粒 ?其主要成分是多聚偏磷酸鹽,可隨菌齡的延長而變大。多聚磷酸鹽顆粒對某些染料有特殊反應,產生與所用染料不同的顏色,因而得名異染顆粒。如用甲苯胺藍、次甲基藍染色后不呈藍色而呈紫紅色。棒狀桿菌和某些芽胞桿菌常含有這種異染顆粒。白喉棒狀桿菌異染顆粒位于菌體兩端,故又稱極體,有助于該菌的鑒定。圖10所示為白喉棒狀桿菌異染顆粒染色結果。




        綜上所述, 臨床微生物學實驗室常規鑒定細菌離不開形態學檢查,很難想象革蘭染色和形態學檢查錯誤會得到正確的鑒定結果,形態學檢查對鑒定細菌起著導航作用,具有重要的價值,臨床微生物學檢驗工作者應予重視。

        參考文獻

        [1] Murray PR. Manual of clinical microbiology[M]. 10th ed. Washington DC: American Society for Microbiology Press, 2011.

        [2]蔡文誠,蔡岳廷. 實用臨床微生物診斷學[M]. 10, 臺北:九州圖書文物有限公司出版,2011.

        [3]谷海瀛.形態學檢查方法的標準化及其在細菌鑒定中的作用.中華檢驗醫學雜志2006,2910):951-953.

        [4]陳東科,孫長貴.實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M]. 1, 北京:人民衛生出版社, 2011.


        來源:微生物之家






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